LY TRÍCH DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP CỘT SILICA

5 (100%) 2 votes

Hiện nay phương pháp ly trích DNA bằng cách sử dụng cột silica đang tỏ ra rất ưu điểm nhanh chóng và đơn giản hơn so với phương pháp tách chiết thủ công. Tất cả các phương pháp ly trích DNA đều nhắm đến mục đích là giải phóng và tinh sạch DNA, trong các giải pháp thì cột silica đem lại sản phẩm sau ly trích đạt được độ tinh sạch cao.

Xem thêm:

Quy trình ly trích DNA bằng cột silica.

Quá trình ly trích phá màng.

Mục đích của quá trình này là phá bỏ màng tế bào và màng nhân của tế bào vi sinh vật, giải phóng DNA/ RNA ra ngoài dung dịch tạo tiền để cho việc thu nhận và tinh sạch DNA. Việc ly trích sẽ sử dụng các loại hóa chất có khả năng biến tính phá vỡ màng tế bào thông qua việc phá vỡ các cấu trúc protein. Các hóa chất ly trích có thành phần và nồng độ đệm ly giải thay đổi tùy theo mục đích tách chiết là ADN hoặc ARN, nhưng về cơ bản đều chứa các muối chaotropic (guanidine HCL, guanidine thiocyanate, urea và lithium perchlorate) ở nồng độ cao, làm mất tính bền vững của liên kết hydro, lực Van der Waals và các tương tác kỵ nước. Do đặc tính này, các chất chaotropic có một số tác dụng sau:

Ly giải màng tế bào,

Biến tính protein, ADN và các đại phân tử khác,

Bất hoạt nuclease,

Thúc đẩy quá trình gắn acid nucleic vào silic.

Ngoài ra, một số chất tẩy rửa (detergent) và enzyme (thường dùng là proteinkinase hoặc lysozyme) cũng được sử dụng nhằm tăng hiệu quả hòa tan protein và quá trình ly giải.

Trong quy trình ly trích DNA plasmid, các chất chaotropic không được thêm vào dung dịch ly giải với mục đích tách plasmid khỏi ADN hệ gen trước, tránh trường hợp cả plasmide và ADN hệ gen đều được giải phóng cùng một lúc vì rất khó để phân tách ADN mạch vòng nhỏ với ADN hệ gen có trọng lượng phân tử cao.

Quá trình gắn cột.

Sau khi biến tính phá vỡ cấu trúc tế bào, DNA/ RNA được giải phóng ra ngoài dung dịch, tiếp theo dung dịch này sẽ được di chuyển qua cột silica để các DNA/ RNA có thể liên kết với các hạt silica  và được giữ lại, các thành phần khác sẽ đi qua và chuyển sang đáy tube từ đó tách được DNA/ RNA ra khỏi dung dịch. Ở bước này các hóa chất theo bộ kit sẽ có nhiệm vụ là tăng cường ái lực giữa hạt silica và DNA/ RNA hỗ trợ quá trình gắn kết, đồng thời có tách dụng rửa

DNA/ RNA giúp loại bỏ các thành phần xác tế bào và hóa chất ly trích ở bước trước đó. Cồn  thường được sử dụng để tăng khả năng gắn của acid nucleic vào silica, thường dùng là ethanol hoặc đôi khi là isopropanol. Nồng độ cồn sẽ được tối ưu hóa để đảm bảo các DNA/ RNA không bị ảnh hưởng, quá nhiều ethanol sẽ làm đứt gãy ADN, ngược lại quá ít ethanol sẽ không thể hỗ trợ cho quá trình rửa.

Rửa.

Đây là bước loại bỏ các thành phần còn sót lại từ quá trình ly trích như protein, polysaccharide, các loại vật chất nội bào nhằm đạt hiệu suất tách chiết và tinh sạch ADN/ ARN cao.

Về cơ bản có 2 cách rửa mẫu.

(1) Nếu mẫu chứa nhiều protein và mẫu ly trích có màu (VD : gan, phân, lá cây…) cần tăng cường ly trích nhẹ với hóa chất ở nồng độ thấp.

(2) Mẫu không chứa nhiều protein như quá trình tách chiết ADN plasmid hoặc tinh sạch sản phẩm PCR, thì có thể chỉ cần dùng ethanol để thực hiện quá trình rửa.

Sau khi rửa

Thực hiện ly tâm làm khô cột nhằm loại ethanol. Nếu cột lọc vẫn còn sót lại ethanol, chất này sẽ đi vào trong phản ứng PCR/ Real time PCR sau đó làm ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng.

Ethanol còn sót lại trong mẫu tách chiết không thể được nhận biết được thông qua kết quả UV 280/260. Do vậy để kiểm tra ethanol còn sót lại là dịch DNA sau ly trích sẽ không đông đá hoàn toàn khi bảo quản ở – 20oC.

Thu hồi DNA/ RNA

Đối với ADN, do đặc tính ổn định ở môi trường pH kiềm nhẹ và tan nhanh trong đệm nên đệm Tris HCl 10mM ở pH nằm trong khoảng 8-9 thường được sử dụng làm đệm rửa giải. Ngược lại ARN lại ổn định tốt trong môi trường pH acid nhẹ và hòa tan hoàn toàn trong nước nên nước là dung dịch phù hợp để rửa giải (pH của nước thường nằm trong khoảng 4-5). Quá trình rửa giải đạt hiệu quả cao nếu cho dung dịch rửa giải vào và chờ 1-2 phút rồi mới đem ly tâm thu dịch.

Để được tư vấn chi tiết, giải đáp thắc mắc, hướng dẫn sử dụng và báo giá cụ thể, hãy liên hệ ngay với Visitech – Công ty TNHH Khoa học Kỹ thuật Việt Sinh qua các thông tin bên dưới:

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *