Kit định danh Listeria API® LISTERIA của bioMérieux là một hệ thống chuẩn hóa sử dụng 10 microtube sinh hóa để xác định các loài thuộc chi Listeria, bao gồm L. monocytogenes, L. innocua, và L. ivanovii, đạt độ chính xác 98%.
Được thiết kế cho các phòng thí nghiệm vi sinh, kit định danh Listeria hỗ trợ phân tích mẫu thực phẩm (như cá hồi hun khói) và mẫu lâm sàng (dịch não tủy), cung cấp kết quả đáng tin cậy trong 18–24 giờ. Hệ thống này sử dụng các phản ứng sinh hóa (DIM, ESC, αMAN, DARL) để tạo mã số 4 chữ số, phân tích qua phần mềm APIWEB™ hoặc ATB™ NEW.
Tuy nhiên, các yếu tố như mẫu nhiễm tạp hoặc lỗi kỹ thuật có thể làm giảm độ tin cậy, đòi hỏi quy trình khẳng định chặt chẽ. Bài viết này trình bày quy trình sử dụng kit định danh Listeria, phân tích nguyên nhân kết quả không đáng tin cậy, và các bước xác minh khoa học, minh họa qua trường hợp mẫu cá hồi hun khói nghi nhiễm L. monocytogenes.
Quy trình định danh với kit định danh Listeria
Kit định danh Listeria hoạt động dựa trên các phản ứng sinh hóa trong 10 microtube, bao gồm thủy phân esculin (ESC), hoạt tính α-mannosidase (αMAN), và acid hóa các hợp chất như D-arabitol (DARL) và xylose (XYL). Quy trình bắt đầu bằng việc nuôi cấy mẫu trên môi trường chọn lọc như Oxford agar, sau đó chọn khuẩn lạc nghi Listeria (xám xanh, vòng đen do esculin).
Huyền phù vi khuẩn được pha trong API Suspension Medium (2 mL), điều chỉnh độ đục đạt 1 McFarland (~3 × 10⁸ CFU/mL) bằng DENSIMAT (Ref. 99234). Huyền phù được phân phối vào các microtube (100 µL cho DIM, 50 µL cho ESC đến TAG), ủ ở 36°C ± 2°C trong 18–24 giờ. Sau ủ, thuốc thử ZYM B được thêm vào giếng DIM, và kết quả được đọc trong 3 phút. Các phản ứng tạo mã số 4 chữ số (ví dụ, 3740), được phân tích qua APIWEB™ để xác định loài.
Trong một trường hợp phân tích mẫu cá hồi hun khói, kit định danh Listeria cho mã số 3740, với kết quả ban đầu từ APIWEB™: L. monocytogenes (85%), Bacillus cereus (10%), Enterococcus faecalis (5%). Độ tin cậy 85% không đáp ứng yêu cầu báo cáo, do đó cần xác minh thêm để loại bỏ các yếu tố gây nhiễu.
Nguyên nhân kết quả không đáng tin cậy
Kết quả từ kit định danh Listeria có thể không đạt độ tin cậy cao do các yếu tố sau:
- Mẫu nhiễm tạp: Sự hiện diện của Bacillus, Enterococcus, hoặc Streptococcus trong mẫu cá hồi có thể gây nhiễu phản ứng sinh hóa. Ví dụ, mẫu từ Oxford agar chứa khuẩn lạc hỗn hợp, làm sai lệch xét nghiệm ESC hoặc αMAN.
- Phản ứng không điển hình: Một số chủng L. monocytogenes biến thể có hồ sơ sinh hóa khác, như DIM âm tính giả, dẫn đến màu hồng xám thay vì cam khi thêm ZYM B.
- Vi khuẩn tương tự: Bacillus cereus (Gram dương, catalase dương tính, tán huyết) hoặc Enterococcus faecalis (thủy phân esculin) có đặc tính gần giống Listeria, gây nhầm lẫn. Trong trường hợp cá hồi, Bacillus cereus bị nghi ngờ do tán huyết tương tự trên Columbia sheep blood agar.
- Lỗi kỹ thuật: Các sai sót như cấy sai lượng huyền phù (quá ít hoặc quá nhiều), bảo quản kit định danh Listeria ngoài 2–8°C, hoặc đọc kết quả DIM muộn (>3 phút) có thể làm giảm độ chính xác. Một trường hợp ghi nhận ZYM B xuống cấp (đổi màu nâu), gây kết quả DIM không rõ.
Những yếu tố này đòi hỏi quy trình xác minh chặt chẽ để đảm bảo kết quả đáng tin cậy.
Quy trình xác minh Listeria với kit định danh Listeria
Để đạt độ tin cậy cao, một quy trình xác minh khoa học được thực hiện, minh họa qua trường hợp mẫu cá hồi hun khói:
- Xác nhận mẫu thuần khiết và đặc tính cơ bản
Mẫu được cấy lại trên Columbia sheep blood agar (Ref. 43041) và ủ ở 36°C trong 24 giờ để đảm bảo thuần khiết. Kết quả cho thấy hai loại khuẩn lạc (nhỏ, tán huyết β; lớn, không tán huyết), xác nhận nhiễm tạp.
Khuẩn lạc nhỏ được chọn, nhuộm Gram, cho thấy que ngắn, Gram dương, không bào tử. Xét nghiệm catalase (H₂O₂ 3%) dương tính (bọt khí), oxidase âm tính, và tính di động ở 25°C (umbrella motility) phù hợp với Listeria, nhưng cần loại trừ Bacillus cereus (catalase dương tính, có bào tử). - Lặp lại xét nghiệm với kit định danh Listeria
Huyền phù từ mẫu thuần khiết được pha đạt 1 McFarland, cấy vào kit định danh Listeria (100 µL cho DIM, 50 µL cho ESC đến TAG), và ủ ở 36°C trong 18 giờ. Thuốc thử ZYM B được thêm vào DIM, và các phản ứng được ghi nhận: ESC (đen, dương tính), αMAN và DARL (vàng, dương tính), RIB và TAG (đỏ, âm tính). Mã số 3740 được tính, với APIWEB™ trả về L. monocytogenes (90%), Bacillus cereus (8%), L. innocua (2%). Độ tin cậy tăng, nhưng vẫn cần xét nghiệm bổ sung. - Thực hiện xét nghiệm bổ sung
Theo Rocourt (1985), các xét nghiệm bổ sung được tiến hành để phân biệt Listeria:- CAMP test: Mẫu được cấy vuông góc với S. aureus ATCC® 25923 trên Columbia sheep blood agar, cho vùng tán huyết hình mũi tên, xác nhận L. monocytogenes và loại trừ Bacillus cereus (CAMP âm tính) và L. innocua (không tán huyết).
- Tán huyết: Mẫu trên Columbia sheep blood agar cho tán huyết β hẹp (1–2 mm), phù hợp L. monocytogenes.
- Nuôi cấy chọn lọc: Trên Oxford agar, khuẩn lạc xám xanh với vòng đen xác nhận Listeria.
- Mannitol và urease: Mẫu âm tính với mannitol (Mannitol Salt Agar) và urease (Urea Agar), loại trừ Bacillus cereus (mannitol dương tính) và Enterococcus faecalis (urease dương tính).
- Bào tử: Nhuộm Schaeffer-Fulton không thấy bào tử, củng cố Listeria.
- Phân tích bối cảnh mẫu
Cá hồi hun khói là môi trường lý tưởng cho L. monocytogenes (phát triển ở 4°C, pH 4.4–9.4, theo CDC). Bacillus cereus liên quan đến thực phẩm nấu chín, ít gặp trong cá hồi lạnh, trong khi Enterococcus phổ biến trong phân. Lịch sử nhiễm Listeria của nhà sản xuất củng cố giả thuyết L. monocytogenes. - Xác minh bằng phương pháp bổ sung
PCR với GeneProof Listeria monocytogenes PCR Kit nhắm gen hly cho kết quả dương tính. Nuôi cấy trong Fraser Broth và chuyển sang ALOA agar (Ref. 43461) tạo vòng xanh lam (phospholipase C), xác nhận L. monocytogenes với độ tin cậy 99.9%. - Báo cáo và hành động
Kết quả cuối cùng xác nhận L. monocytogenes (mã số 3740, CAMP dương tính, tán huyết β, gen hly dương tính), loại trừ Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, và L. innocua. Nhà sản xuất được thông báo thu hồi lô cá hồi, vệ sinh dây chuyền, và kiểm tra thêm mẫu, ngăn chặn nguy cơ ngộ độc thực phẩm.
Lưu ý thực hành để tối ưu hóa kit định danh Listeria
Để đảm bảo kết quả chính xác khi sử dụng kit định danh Listeria, cần tuân thủ các lưu ý sau:
- Mẫu thuần khiết: Cấy lại mẫu trên Columbia sheep blood agar để loại bỏ tạp khuẩn như Bacillus hoặc Enterococcus, đảm bảo khuẩn lạc biệt lập.
- Bảo quản: Lưu trữ kit định danh Listeria và ZYM B ở 2–8°C, tránh ánh sáng. Kiểm tra ZYM B không đổi màu nâu, dấu hiệu xuống cấp.
- An toàn sinh học: Xử lý mẫu trong tủ an toàn sinh học cấp II, tuân thủ CLSI M29-A, sử dụng găng và kính bảo hộ khi thao tác với ZYM B (dễ cháy, độc).
- Chủng chuẩn: Sử dụng L. monocytogenes ATCC® 19115 (mã 6510) để kiểm tra chất lượng lô kit mới.
- Tham khảo: Đối chiếu kết quả với Bergey’s Manual (Sneath, 1986) hoặc Microbe Online để phân biệt Listeria với các vi khuẩn tương tự.
Để tìm hiểu và trao đổi thêm về các thông tin liên quan đến các sản phẩm liên quan đến các loại kit định danh vi khuẩn các bạn có thể liên hệ chúng tôi thông qua:
- Email: info@visitech.vn – pkd@visitech.vn
- Hotline: 0919.112.141 – 0916.07.23.23
- Website: https://visitech.vn/
- Địa chỉ: 539 Lũy Bán Bích, P. Phú Thạnh, Q. Tân Phú, Tp.HCM
- Chỉ đường: Công ty TNHH Khoa Học Kỹ Thuật Việt Sinh