CÁCH SỬ DỤNG CHI TIẾT BỘ KIT ĐỊNH DANH VI KHUẨN API 20E

Hướng dẫn sử dụng API 20E của bioMérieux cung cấp phương pháp chuẩn hóa để định danh vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae và các trực khuẩn Gram âm khác, với cơ sở dữ liệu hơn 690 loài và độ chính xác khoảng 90%.

Hướng dẫn sử dụng API 20E tích hợp 20 xét nghiệm sinh hóa trong một dải nhựa nhỏ gọn, sử dụng chất nền đông khô và thuốc thử để tạo mã số sinh hóa 7 chữ số, phân tích qua APIWEB™ hoặc Analytical Profile Index trong 18–24 giờ.

Công cụ này được ứng dụng trong chẩn đoán y tế (nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng máu), kiểm tra an toàn thực phẩm (phát hiện Escherichia coli, Salmonella), nghiên cứu vi sinh, và đào tạo vi sinh học.

Bài viết này trình bày hướng dẫn sử dụng API 20E qua quy trình chi tiết, từ chuẩn bị mẫu đến định danh, kèm thông tin về thiết bị/vật tư, lỗi tiềm ẩn, và biện pháp khắc phục để đảm bảo kết quả chính xác.

Tổng quan về API 20E

Hướng dẫn sử dụng API 20E dựa trên hệ thống 20 microtube chứa chất nền sinh hóa để đánh giá đặc tính vi khuẩn.

Các xét nghiệm bao gồm:

• Phát hiện enzyme (β-galactosidase trong ONPG, urease trong URE), phân giải hợp chất (arginine trong ADH, lysine trong LDC, ornithine trong ODC, tryptophan trong TDA, indole trong IND), sản xuất hydrogen sulfide (H2S), sử dụng citrate làm nguồn carbon (CIT), sản xuất acetoin (VP), phân giải gelatin (GEL), khử nitrat thành nitrit hoặc khí nitơ (NIT),
• Lên men các đường (glucose trong GLU, mannitol trong MAN, inositol trong INO, sorbitol trong SOR, rhamnose trong RHA, sucrose trong SAC, melibiose trong MEL, amygdalin trong AMY, arabinose trong ARA).
  Sau khi ủ, các thuốc thử (Ferric Chloride cho TDA, Kovacs’ Reagent cho IND, KOH và α-Naphthol cho VP, Sulfanilic acid và α-Naphthylamine cho NIT, Zinc dust cho NIT) được thêm để hiện màu, tạo mã số sinh hóa dùng để định danh.

Hướng dẫn sử dụng API 20E phục vụ kỹ thuật viên phòng thí nghiệm, nhà nghiên cứu vi sinh, và sinh viên trong các ứng dụng thực tiễn và học thuật.

Thiết bị và vật tư cần thiết

Hướng dẫn sử dụng API 20E yêu cầu các thiết bị và vật tư để đảm bảo thực hiện chính xác.

Thiết bị bao gồm tủ an toàn sinh học cấp II để duy trì môi trường vô trùng, tủ ủ ở 37°C để tạo điều kiện tối ưu cho phản ứng sinh hóa, kính hiển vi quang học (1000x) để xác nhận vi khuẩn Gram âm sau nhuộm Gram, máy đo độ đục hoặc thẻ chuẩn McFarland 0.5 để điều chỉnh huyền phù vi khuẩn (~1.5 × 10⁸ CFU/mL), pipet vô trùng (100 µL, 1000 µL) để phân phối huyền phù và thuốc thử, và đèn chiếu sáng trắng hoặc kính lúp để quan sát màu sắc microtube.

Vật tư bao gồm dải API 20E với 20 microtube chứa chất nền sinh hóa, khay ủ và nắp đậy để giữ độ ẩm, API NaCl 0.85% Medium (5 mL) để pha huyền phù, API Mineral Oil để tạo môi trường kỵ khí cho các xét nghiệm ADH, LDC, ODC, H2S, URE, GE.
Các thuốc thử (Ferric Chloride, Kovacs’ Reagent, KOH, α-Naphthol, Sulfanilic acid, α-Naphthylamine, Zinc dust) để kích hoạt phản ứng.

Môi trường nuôi cấy (MacConkey, EMB, Nutrient Agar) để phân lập vi khuẩn, thuốc nhuộm Gram (crystal violet, iodine, safranin) để xác nhận vi khuẩn Gram âm, vòng que cấy vô trùng, ống nghiệm, bút đánh dấu, nước cất vô trùng (5 mL) để duy trì độ ẩm khay ủ, và đồ bảo hộ (găng tay, kính, khẩu trang) để đảm bảo an toàn khi thao tác với hóa chất và vi khuẩn.

Quy trình chi tiết theo hướng dẫn sử dụng API 20E

Hướng dẫn sử dụng API 20E bao gồm sáu bước để định danh vi khuẩn một cách khoa học:

1. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn
   Mẫu (máu, nước tiểu, thực phẩm) được cấy trên môi trường chọn lọc như MacConkey hoặc EMB, ủ ở 37°C trong 18–24 giờ để thu khuẩn lạc. Một khuẩn lạc tròn, mịn, biệt lập được chọn và nhuộm Gram (crystal violet, iodine, safranin) để xác nhận trực khuẩn Gram âm (màu hồng dưới kính hiển vi 1000x). Sau đó, 1–2 khuẩn lạc được hòa vào 5 mL API NaCl 0.85% Medium, lắc đều để đạt độ đục McFarland 0.5 (~1.5 × 10⁸ CFU/mL).
   Lỗi tiềm ẩn bao gồm chọn khuẩn lạc lẫn tạp khuẩn, dẫn đến kết quả sai; huyền phù quá đục hoặc loãng, làm phản ứng lệch; hoặc bỏ qua nhuộm Gram, chọn sai vi khuẩn. Để khắc phục, cần cấy lại mẫu nếu nghi nhiễm tạp, điều chỉnh độ đục bằng cách thêm vi khuẩn hoặc pha loãng, và luôn thực hiện nhuộm Gram.
2. Chuẩn bị dải API 20E
   Dải API 20E được kiểm tra hạn sử dụng và tính nguyên vẹn của các microtube (ONPG, ADH, GLU, v.v.). Mã mẫu (ví dụ, “Mẫu thực phẩm 01”) được ghi bằng bút chống nước. Dải được đặt vào khay ủ, và 5 mL nước cất vô trùng được đổ vào rãnh khay để duy trì độ ẩm.
   Lỗi tiềm ẩn gồm sử dụng dải hết hạn hoặc hư hỏng, làm chất nền biến tính; thiếu nước cất, gây khô microtube; hoặc ghi sai mã mẫu, dẫn đến nhầm lẫn. Để khắc phục, bảo quản dải ở 2–8°C, đo chính xác 5 mL nước cất, và đối chiếu mã mẫu với mẫu gốc.
3. Thêm huyền phù vi khuẩn
   Trong tủ an toàn sinh học, 100 µL huyền phù vi khuẩn được nhỏ vào mỗi microtube từ ONPG đến ARA bằng pipet vô trùng. Các microtube ADH, LDC, ODC, H2S, URE, GEL được thêm một giọt API Mineral Oil để tạo môi trường kỵ khí. Khay được đậy kín để giữ độ ẩm.
   Lỗi tiềm ẩn bao gồm nhỏ sai lượng huyền phù (quá nhiều gây tràn, quá ít làm phản ứng yếu), quên dầu khoáng, làm hỏng phản ứng kỵ khí, hoặc nhiễm khuẩn chéo giữa các microtube. Để khắc phục, sử dụng pipet chính xác, đánh dấu microtube cần dầu khoáng, và thay đầu pipet mỗi microtube.
4. Ủ dải API 20E
   Khay ủ chứa dải API 20E được đặt trong tủ ủ ở 37°C ± 1°C trong 18–24 giờ, đảm bảo nắp khay kín và không rung lắc.
   Bạn có thể mắc lỗi nhiệt độ sai (trên 38°C làm chết vi khuẩn, dưới 36°C làm phản ứng chậm), thời gian ủ không đúng (dưới 18 giờ làm phản ứng chưa hoàn tất, trên 24 giờ gây phản ứng giả), hoặc khay khô do thiếu nước cất. Để khắc phục, kiểm tra nhiệt độ bằng nhiệt kế, ghi thời gian ủ, và đảm bảo 5 mL nước cất trong khay.
5. Thêm thuốc thử và đọc kết quả
   Sau ủ, khay được mở trong tủ an toàn sinh học. Một số microtube tự hiện phản ứng: ONPG (vàng, dương tính), CIT (xanh lam, dương tính), H2S (kết tủa đen, dương tính), URE (đỏ/cam, dương tính), GEL (khuếch tán, dương tính), và các xét nghiệm đường (GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA) (vàng, dương tính).
   Các microtube khác cần thuốc thử: Ferric Chloride (TDA, nâu đỏ trong 10 giây, dương tính), Kovacs’ Reagent (IND, đỏ bề mặt trong 2 phút, dương tính), KOH và α-Naphthol (VP, đỏ sau 10–15 phút, dương tính), Sulfanilic acid và α-Naphthylamine (NIT, đỏ trong 2 phút, dương tính; nếu không đổi màu, thêm Zinc dust, đỏ sau 5 phút là âm tính, không đỏ là dương tính).
   Kết quả được ghi vào bảng ghi, đánh dấu “+” (dương tính) hoặc “–” (âm tính). Lỗi tiềm ẩn gồm thêm sai lượng thuốc thử, quan sát sai thời điểm, thuốc thử hỏng, hoặc ghi sai kết quả. Để khắc phục, sử dụng pipet nhỏ giọt chính xác, chờ đúng thời gian, kiểm tra hạn sử dụng thuốc thử, và kiểm tra lại bảng ghi.
6. Tính mã số và định danh vi khuẩn
   Hai mươi xét nghiệm được chia thành 7 nhóm (6 nhóm 3 xét nghiệm, nhóm cuối 2 xét nghiệm). Mỗi xét nghiệm dương tính được gán điểm: xét nghiệm đầu (1), thứ hai (2), thứ ba (4). Điểm trong mỗi nhóm được cộng (0–7) để tạo mã số 7 chữ số.
   Mã số được nhập vào APIWEB™ hoặc tra trong Analytical Profile Index để định danh loài. Nếu mã số không rõ, xét nghiệm bổ sung với API M Medium được thực hiện. Lỗi tiềm ẩn gồm tính sai mã số hoặc tra cứu nhầm loài. Để khắc phục, kiểm tra bảng ghi kỹ lưỡng, tính điểm cẩn thận, và sử dụng APIWEB™ để xác suất chính xác.

Lưu ý thực hành theo hướng dẫn sử dụng API 20E

Để tối ưu hóa hướng dẫn sử dụng API 20E, cần tuân thủ các lưu ý sau:

• Vô trùng: Thao tác trong tủ an toàn sinh học cấp II, đeo găng tay, thay đầu pipet mỗi microtube để tránh nhiễm khuẩn chéo.
• Ghi chép: Ghi rõ thời gian ủ, mã mẫu, và kết quả để tránh nhầm lẫn khi xử lý nhiều mẫu.
• Kiểm tra chất lượng: Sử dụng vi khuẩn chuẩn (E. coli ATCC 25922) để kiểm tra dải thử và thuốc thử, đảm bảo hạn sử dụng và màu sắc bình thường.
• Bảo quản: Lưu trữ dải API 20E và thuốc thử (Kovacs’ Reagent, Ferric Chloride, v.v.) ở 2–8°C, kiểm tra không có dấu hiệu biến tính.

Kết luận

Hướng dẫn sử dụng API 20E cung cấp quy trình chuẩn hóa để định danh vi khuẩn Enterobacteriaceae và trực khuẩn Gram âm với độ chính xác 90% trong 18–24 giờ.
Quy trình 6 bước, từ chuẩn bị mẫu đến định danh, cùng biện pháp khắc phục lỗi, đảm bảo kết quả đáng tin cậy trong chẩn đoán y tế, kiểm tra an toàn thực phẩm, nghiên cứu vi sinh, và giáo dục. Hướng dẫn sử dụng API 20E là tài liệu thiết yếu cho các phòng thí nghiệm vi sinh, hỗ trợ xử lý mẫu hiệu quả và chính xác.

Liên hệ để tìm hiểu thêm

Để biết thêm về hướng dẫn sử dụng API 20E hoặc các sản phẩm của bioMérieux, vui lòng liên hệ:

• Email: info@visitech.vn – pkd@visitech.vn
• Hotline: 0919.112.141 – 0916.07.23.23
• Website: https://visitech.vn/
• Địa chỉ: 539 Lũy Bán Bích, P. Phú Thạnh, Q. Tân Phú, Tp.HCM
• Chỉ đường: Công ty TNHH Khoa Học Kỹ Thuật Việt Sinh