Thao tác thực hiện kiểm Vibrio spp. theo TCVN – Khuẩn lạc Vibrio spp. (Phần 2)

5. Khẳng định

5.1 Yêu cầu chung của thực hiện kiểm Vibrio spp.:

Có thể sử dụng các bộ kit thử nhận dạng sinh hóa có sẵn để nhận dạng Vibrio đến mức độ loài, với điều kiện là chúng được cấy với các huyền phù của vi khuẩn cần nhận dạng trong môi trường muối thích hợp hoặc dịch pha loãng và với điều kiện là bảng dữ liệu hoặc bảng nhận dạng đối với sản phẩm đã dựa trên các phản ứng thu được khi sử dụng môi trường tương tự như mô tả trong tiêu chuẩn này. Sử dụng các bộ kit thử này theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Thao tác thực hiện kiểm Vibrio spp. theo TCVN – Khuẩn lạc Vibrio spp. (Phần 1)

CHÚ THÍCH:

Việc nhận biết các khuẩn lạc Vibrio đòi hỏi phải có nhiều kinh nghiệm và hình dạng bên ngoài của chúng đôi khi có thể không chỉ thay đổi từ loài này sang loài khác, mà còn có thể thay đổi từ mẻ môi trường cấy này đến mẻ môi trường cấy khác.

5.2 Chọn lọc các khuẩn lạc để khẳng định và chuẩn bị dịch cấy tinh khiết

– Để khẳng định, từ mỗi môi trường chọn lọc, lấy ra ít nhất năm khuẩn lạc được coi là điển hình hoặc giống với từng Vibrio spp. có khả năng gây bệnh để cấy truyền. Nếu trên đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc của loài đích thì cấy truyền tất cả các khuẩn lạc này. – Cấy các khuẩn lạc đã chọn lên bề mặt các đĩa thạch muối dinh dưỡng hoặc mặt nghiêng của thạch muối dinh dưỡng để thu được các khuẩn lạc tách biệt tốt. Ủ các đĩa đã cấy  ở 37^oC trong 24h ± 3h. Sử dụng các dịch cấy tinh khiết này để khẳng định sinh hóa.

5.3 Các phép thử nhận dạng giả định (Thực hiện kiểm Vibrio spp. giả định)

*PT1:

Phép thử phản ứng oxidaza Dùng vòng lấy mẫu, que thẳng bằng platin hoặc đũa thủy tinh, lấy một phần dịch cấy tinh khiết từ thạch muối dinh dưỡng và cấy vào test thử oxidaza. Không sử dụng vòng lấy mẫu bằng niken-crom hoặc que bằng kim loại. Phép thử được coi là dương tính nếu màu chuyển sang màu tím hoa cà, màu tím hoặc tím sẫm trong 10 s.

*PT2: Kiểm tra bằng kính hiển vi

Với mỗi dịch cấy tinh khiết thu được tiến hành kiểm tra theo a) và b) như sau:

1. a) Nhuộm Gram. Sau khi nhuộm, kiểm tra hình thái và phản ứng Gram bằng kính hiển vi và ghi lại kết quả.
2. b) Cấy vào ống đựng dung dịch nước pepton muối kiềm (ASPW). Ủ ở 37^oC trong khoảng từ 1 h đến 6h. Cho một giọt dịch cấy lên phiến kính sạch, đậy làm men và kiểm tra tính di động dưới kính hiển vi. Ghi lại các ống cho kết quả dương tính về tính di động.

*PT3: Chọn dịch cấy để thử sinh hóa

Giữ lại các khuẩn lạc dương tính oxidaza và âm tính Gram cho kết quả dương tính về tính di động để khẳng định sinh hóa.

5.4 Khẳng định sinh hóa

5.4.1 Thử nghiệm trên thạch TSI

Cấy đâm sâu xuống đáy ống thạch và cấy ria theo mặt nghiêng của thạch. Ủ ở 37^oC trong 24h ± 3h. Diễn giải các phản ứng như sau:

1. a) Quan sát ở đáy cột thạch

– Màu vàng: dương tính glucoza (lên men glucoza); – Màu đỏ hoặc không đổi màu: âm tính glucoza (không lên men glucoza); – Màu đen: sinh khí hydro sulfua; – Có bọt hoặc rạn nứt: sinh khí từ glucoza

1. b) Quan sát trên mặt nghiêng của thạch

– Màu vàng: dương tính lactoza và/hoặc sacaroza (sử dụng lactoza và/hoặc sacaroza); – Màu đỏ hoặc không đổi màu: âm tính lactoza (không sử dụng lactoza hoặc sacaroza); Các phản ứng điển hình của V. vulnificus và V. fluvialis ứng với cấy bề mặt nghiêng axit (màu vàng) và cấy đâm sâu axit (màu vàng) mà không sinh hydro sulfua hoặc khí. Các phản ứng điển hình của V. mimicus ứng với cấy bề mặt nghiêng kiềm (màu đỏ) (đôi khi bề mặt nghiêng axit: màu vàng) và cấy đâm sâu axit (màu vàng) mà không sinh hydro sulfua hoặc khí.

5.4.2 Phát hiện ornithin tách nhóm cacboxyl (decarboxylaza)

Cấy sinh khối vào môi trường ODC. Thêm khoảng 1 ml dầu khoáng vô trùng lên mặt môi trường. Ủ ở 37^oC trong 24h ± 3h. Sau khi ủ mà thấy đục hoặc có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính [có vi khuẩn mọc và có sự tách nhóm cacboxyl của ornithin]. Màu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính.

5.4.3 Phát hiện L-lyzin tách nhóm cacboxyl (decarboxylaza)

Cấy sinh khối vào môi trường LDC. Thêm khoảng 1 ml dầu khoáng vô trùng lên mặt môi trường. Ủ ở 37^oC trong 24h ± 3h. Sau khi ủ mà thấy đục hoặc có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính [có vi khuẩn mọc và có sự tách nhóm cacboxyl của lyzin]. Màu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính.

5.4.4 Phát hiện dihydrolaza arginin

Cấy sinh khối vào môi trường ADH. Thêm khoảng 1 ml dầu khoáng vô trùng lên mặt môi trường. Ủ ở 37^oC trong 24h ± 3h. Sau khi ủ mà thấy đục hoặc có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính [có vi khuẩn mọc và có sự dihydrolaza arginin]. Màu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính.

5.4.5 Phát hiện β-galactoxidaza

Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,25 ml dung dịch muối. Thêm 1 giọt toluen và lắc ống. Đặt ống vào nồi cách thủy để ở 37^oC và để yên khoảng 5 min. Thêm 0,25 ml thuốc thử phát hiện β-galactoxidaza và trộn. Đặt ống vào nồi cách thủy để ở 37^oC, để yên trong 24h ± 3h, kiểm tra liên tục. Màu vàng chứng tỏ phản ứng dương tính (có mặt β-galactoxidaza). Phản ứng thường xảy ra sau 20 min. Sau 24 h không có màu chứng tỏ phản ứng âm tính. Nếu sử dụng các đĩa giấy thì Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,25 ml dung dịch muối có chứa đĩa giấy ONPG.

5.4.6 Phát hiện indol

– Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5 ml môi trường muối trypton-tryptophan. – Ủ ở 37^oC trong 24h ± 3h. – Sau khi ủ, thêm 1 ml thuốc thử Kovacs. Việc hình thành vòng màu đỏ chứng tỏ phản ứng dương tính (hình thành indol). Vòng màu nâu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính.

5.4.7

Phép thử khả năng chịu mặn Chuẩn bị một dãy các dung dịch pepton với nồng độ muối (NaCl) tăng dần: 0 %, 2 %, 4 %, 6 %, 8 % và 10 %. Chuẩn bị huyền phù có khuẩn lạc cần nhận dạng và cấy nhẹ vào mỗi ống (bằng một vòng cấy đầy). Ủ ở 37 0C trong 24 h ± 3 h. Nếu quan sát thấy đục chứng tỏ vi khuẩn nghi ngờ có thể phát triển với nồng độ natri clorua có mặt trong ống đựng nước pepton muối.

5.4.8 Diễn giải các phép thử sinh hóa Các loài Vibrio spp. có khả năng gây bệnh đường ruột thường cho các phản ứng như trong Bảng 1.

Các phản ứng của V. cholerae và V. parahaemolyticus được nêu trong TCVN 7905-1:2008

Phép thử	V. choleraea	V. mimicusa	V. parahaemolyticusa	V. vulnificusa	V. fluvialisa
Oxidaza	+	+	+	+	+
Sinh khí (glucoza)	–	–	–	–	–
Lactoza	–	–	–	+	–
Sacaroza	+	–	–	–	+
ODC	+	+	+	+	–
LDC	+	+	+	+	–
ADH	–	–	–	–	+
Thủy phân ONPG	+	+		+	+
Sinh indol	+	+	+	+	b
Sinh trường trong nước pepton với 0 % NaCl 2 % NaCl 6 % NaCl 8 % NaCl 10 % NaCl	+ + – – –	+ + – – –	– + + + –	– + + – –	– + + – –
a Dấu + nghĩa là từ 76 % đến 89 % dương tính. b Các kết quả đáng tin cậy

Click vào Đây để xem các thao tác thực hiện kiểm Vibrio spp. phần 1.