Một số phương pháp PCR cải biên – Visitech.vn

Các phương pháp PCR cải biên được biết đến:

I. Reverse transcription PCR (RT – PCR):

• Thực hiện đối với mẫu RNA.
• RT – PCR chuyển RNA thành cDNA bằng enzyme reverse transcripetase, sau đó sử dụng cDNA cho phản ứng.
• Thành phần phản ứng: PCR buffer, Nucleotide Mix, Random Hexamers, MgCl₂, Reverse Transcriptase RNase inhibitor (tuy nhiên RNase rất dễ nhiễm, bền, có thể tồn tại ở tay/ bao tay).
• Các loại mồi cần cho phản ứng RT – PCR:

1. Oligo-dT:

• Chuyên biệt cho mRNA của Eukaryote.
• Không có tác dụng với rRNA, RNA của virus, RNA phân mảnh trong quy trình tinh sạch.
• Khó tạo cDNA hoàn chỉnh cho các gene nằm ở đầu 5’ của mRNA.

2. Random dexamer – Mồi ngẫu nhiên:

• Bắt cặp tại nhiều vùng trên RNA -> tạo nhiều bản cDNA từ một trình tự RNA.
• Sử dụng khi số lượng RNA ít.
• Có tác dụng với cả rRNA -> Ức chế phản ứng với những RNA mục tiêu nồng độ thấp.

3. Mồi đặc hiệu:

• Đảm bảo hiệu suất tạo cDNA của mục tiêu.
• Hạn chế về khả năng khảo sát cDNA của nhiều gene cùng một lúc.

Babesia qPCR Visikit ANIFR-03

II.

1. Nested PCR:

• Chuẩn bị 2 ống PCR -> thực hiện PCR 1 ống ra sản phẩm -> lấy 1 lượng nhỏ qua ống 2 (pha loãng) -> ống 2: sử dụng cặp primer khác bắt cặp phía trong cặp primer thứ 1 -> thực hiện PCR -> Sản phẩm cuối.

2. Semi-nested PCR:

• Tương tự Nested PCR nhưng ở ống số 2: giữ lại 1 trong 2 đoạn primer, chỉ thay đổi 1 primer so với ống số 1.
• Tạo được sản phẩm PCR
• Ưu điểm:

• Tăng độ nhạy.
• Tăng độ đặc hiệu.
• Đánh giá tương đối nồng độ DNA mục tiêu.

• Nhược điểm:

• Nguy cơ ngoại nhiễm cao.
• Tốn hóa chất.
• Tốn thời gian.

III. Multiplex PCR:

• Là phương pháp PCR sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi khác nhau.
• Mỗi cặp mồi cho ra một vạch sản phẩm riêng.
• Yêu cầu cao trong thiết kế mồi:

+ Primer-dimer (do sự bắt ccặp chéo giữa các mồi).

+ Sản phẩm ký sinh (càng nhiều mồi, càng bắt ở nhiều vị trí khác nhau -> không đặc hiệu).

• Phát hiện nhiều gene cùng một lúc.
• Ưu điểm:

• Phát hiện nhiều trình tự mục tiêu cùng lúc.
• Kiểm soát chất lượng phản ứng PCR.

• Nhược điểm:

• Khó thiết kế và tối ưu hóa.
• Độ nhạy giảm so với PCR đơn (singleplex PCR).

Để được tư vấn chi tiết về phương pháp PCR, giải đáp thắc mắc, hướng dẫn sử dụng và báo giá cụ thể, hãy liên hệ ngay với Visitech – Công ty TNHH Khoa học Kỹ thuật Việt Sinh qua các thông tin bên dưới:

• Email: info@visitech.vn – pkd@visitech.vn
• Hotline: 0919.112.141 – 0916.07.23.23
• Website: https://visitech.vn/
• Địa chỉ: 539 Lũy Bán Bích, P. Phú Thạnh, Q. Tân Phú, TPHCM