Quy trình Kỹ thuật Real-time PCR phát hiện virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm

Sơ đồ thực hiện Quy trình thực hiện Kỹ thuật Real-time PCR phát hiện virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm:

Mẫu bệnh phẩm -> Đồng nhất mẫu trong dung dịch PBS -> Tách chiết DNA -> Real-time PCR -> Đọc kết quả.

1. Chuẩn bị mẫu (Chuẩn bị đầy đủ Nguyên vật liệu để thực hiện Quy trình):
   

• Mẫu được sử dụng để xét nghiệm với Quy trình thực hiện Kỹ thuật Real-time PCR phát hiện virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm thường là mẫu tươi, ngoài ra có thể là mẫu được cố định trong cồn 90%. Các bộ phận như: Giáp đầu ngực, đuôi, mang, chân bơi, máu, cơ bụng hoặc ấu trùng (của các loài như tôm sú, tôm thẻ chân trắng…
• Dùng kẹp và kéo vô trùng để thao tác cắt lấy mẫu. Chia làm 2 phần: 1 cho xét nghiệm và 1 để lưu trữ.
• Mẫu được nghiền nhuyễn trong dung dịch muối đệm PBS (Phophate Buffered Saline) theo tỷ lệ thể tích 1:9. Cho huyễn dịch vào ống nắp vặn vô trùng và đưa vào tủ âm sâu (-80^oC) tối thiếu 1h trước khi tách chiết.

2. Tách chiết DNA:

• Quy trình tách chiết thực hiện theo hướng dẫn của bộ Kit.

3. Thực hiện phản ứng Real-time PCR:

• • Đặt tube PCR hoặc đĩa PCR 96 giếng chứa thành phần phản ứng Real-time PCR (Master Mix) và mẫu DNA vào máy Real-time PCR. Vận hành máy và cài đặt chương trình theo Hướng dẫn.
  • Chuẩn bị Master Mix và chu kỳ luân nhiệt (Chi tiết xin vui lòng liên hệ về Công ty TNHH Khoa Học Kỹ Thuật Việt Sinh).

4. Đọc kết quả:

Kết quả của phản ứng Real-time PCR phát hiện virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct).

Kiểm tra hệ thống mẫu đối chứng dương và âm. Nếu hệ thống mẫu đối chứng đúng thì baseline theo 5% tín hiệu huỳnh quang và đọc kết quả theo baseline này.

• Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính.
• Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct trùng khớp với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó.
• Nếu 1 trong 4 hệ thống mẫu đối chứng không đúng thì phải thực hiện lại xét nghiệm.

Giải thích kết quả phản ứng Real-time PCR phát hiện virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm.

• Thực hiện 45 chu kỳ:

        + Mẫu có giá trị Ct < 40 là dương tính.

        + Mẫu không có giá trị Ct là âm tính.

        + Mẫu có giá trị Ct nằm trong khoảng 40 <= Ct <= 45 được xem là nghi ngờ. Những mẫu nghi ngờ này cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương để khẳng định  lại kết quả.

Trên đây là các bước cơ bản trong Quy trình thực hiện Kỹ thuật Real-time PCR phát hiện virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm theo Tiêu chuẩn Cơ sở của Cục Thú Y. Để được tư vấn thông tin chi tiết cụ thể hơn, quý khách vui lòng gửi về địa chỉ mail: info@visitech.vn hoặc liên hệ trực tiếp qua hotline của Công ty TNHH Khoa Học Kỹ Thuật Việt Sinh.